细胞器的分离与测量操作过程中应注意什么?
1新鲜取出的小鼠肝脏为组织块,为了得到细胞核和线粒体,首先需要进行匀浆,将细胞从组织块中分离出来,然后再经过进一步匀浆,使细胞膜破碎,细胞解体,各种细胞器被分离出来;同时,0.25mol/L蔗糖溶液,使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下,使得细胞更容易破碎,匀浆彻底;
2.2细胞中,各种细胞器的结构、大小、比重及在同一介质中的沉降系数都是不同的。因此,细胞器的分离,通常使用的 *** 是最匀浆液进行离心,根据细胞器不同的大小、比重及沉降系数,选择合适的离心 *** 组合,就可以将不同的细胞器进行分离,得到富集的某种细胞器。常用的细胞器离心分离技术有差速离心和密度梯度离心:
2.21密度梯度离心(density gradient centrifugation)
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求:1)能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;2)PH中性或易调为中性;3)浓度大时渗透压不大;4)对细胞无毒。
在实验中,我们使用的介质为蔗糖,称为蔗糖密度梯度离心法。原理是:采用不同浓度的蔗糖溶液,预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度,在其上面再加上一层少量的大分子溶液后,离心,大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分,就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码,取出样品池内的溶液,然后进行研究。
2.22差速离心(differential centrifugation)
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的 *** 分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低,让较大的颗粒沉降到管底,小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀,改用较高的离心速度离心悬浮液,将较小的颗粒沉降,以此类推,达到分离不同大小颗粒的目的。
2.23离心力和转速的换算公式
RCF = 1.118 × 10-5 × N2 × R
RCF表示相对离心力,单位为g
N表示转速,单位为rpm转/分
R表示离心半径,单位为cm
2.3染色 ***
2.31甲基绿-派洛宁染色
甲基绿、派洛宁为两种碱性染料,与带负电和的磷酸根形成盐键。甲基绿分子有两个正电荷,易与双链DNA分子结合,使DNA显示绿色,派洛宁分子有一个正电荷,易与单链RNA分子结合,使RNA显示红色。也有人认为染色原理与核酸分子的空间构型有关。细胞核中,核仁的主要成分是RNA,而核仁外围为DNA与RNA的混合物,在细胞的不同活性状态下,外围的DNA和RNA的比例是不一样的,因此着色后的混合色也不一样,但一般情况下DNA的含量占优势,因此染色后,细胞核可以清晰地区分出被染成红色的核仁和显示混合蓝绿色的外围物质。
2.32中性红-詹纳斯绿染色
中性红是一种弱碱性 pH 指示剂,变色范围 pH6.4~8.0之间(由红变黄)。在中性或微碱性环境中,中性红的阳离子,与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合,而使原生质与细胞核染色。詹纳斯绿 ,常用作线粒体专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态.
3.实验材料及设备
3.1实验工具设备:高速冷冻离心机、显微镜、玻璃匀浆器、解剖剪、天平、滴管、移液枪、移液管、洗耳球、镊子、离心管、小烧杯、载玻片、盖玻片、试管、吸水纸、注射器、牙签等;
3.2实验材料试剂:新鲜小鼠肝脏、生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖溶液、0.88mol/L蔗糖溶液、PBS溶液、95%乙醇、丙酮、甲基绿—派洛宁、中性红—詹纳斯绿、蒸馏水、冰块。
4.实验 *** 步骤及注意事项
4.1实验 *** 步骤:
4.11称取0.5g小鼠肝脏置于小烧杯中,用解剖剪将其剪碎,然后用生理盐水清洗数次,最后用0.25mol/L的蔗糖溶液清洗一次;
4.12将清洗好的小鼠肝脏置于玻璃匀浆器中加入1.5ml0.25mol/L的蔗糖溶液即可进行细胞匀浆,待其充分匀浆后备用;
4.13取1.5ml匀浆置离心管中,600g(3000r/min)离心10min,上清液留作线粒体分离;
4.14沉淀用1ml0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次,每次1000g(3900r/min)离心10min;
4.15纯化:将沉淀用500μL0.34mol/L蔗糖溶液悬浮,然后用注射器加入0.88mol/L蔗糖溶液400μL,1500g(4800r/min)离心15—20min;
4.16用PBS溶液悬浮——干燥——95%乙醇固定(5min)——甲基绿-派洛宁染色20-30min——丙酮分离30S——蒸馏水漂洗——吸干镜检;
4.17步骤3的上清液置离心管,10000g(12270r/min)离心10min,沉淀用预冷0.25mol/L蔗糖溶液悬浮,然后10000g(12270r/min)离心10min两次;
4.18在载玻片上滴加1-2滴中性红—詹纳斯绿,然后用牙签挑取沉淀均匀涂抹于玻片上,盖上盖玻片,染色5min即可镜检。
4.2注意事项:
4.21整个实验的操作都要在较低的温度下进行,一般需要在4度以下,以保证经过匀浆之后,细胞器能够在低活性状态下,保持比较完整的形状,所以实验的操作过程中都需要采取冰浴或者通过其他方式保持低温条件;
4.22使用离心机时应注意离心管内液体的配平;离心开始前或者离心完成后,不能保持离心机盖长时间开放,以免使离心机温度升高,影响离心效果;
4.23在对细胞核进行染色时,需要控制好甲基绿-派洛宁染色的时间,也要把握好用丙酮洗脱的时间,才能保证细胞核中的DNA能够显示甲基绿的染色效果。
4.24在进行线粒体的分离观察时,需要保证所取的动物组织是新鲜的,才能观察到明显的线粒体的形态。
5.参考文献
[1]翟中和,王喜忠,丁明孝.细胞生物学.北京:高等教育出版社,2007.
[2] 崔泳 王金生 张文海 周勇. 冷保存鼠肝脏细胞线粒体的分离[J].中国医科大学学报.2000年8月.第29卷第4期.
二、实验报告
1.实验现象及结果分析
1.1细胞核的观察
1.11现象:在显微镜下,可看到富集分离的细胞核,细胞核呈圆球形,核中央可见到两个或多个被染成红色的核仁,外围的物质被染成蓝绿色,但仔细观察,发现细胞核中蓝绿色的着色部分中混有红色
1.12结果分析:核仁中的主要成分是RNA,被派洛宁染成红色,外围物质中主要是DNA,被甲基绿染成蓝绿色,但是外围物质中同样分布有一定量的RNA,因此可看到蓝绿色中混有的红色。
1.2线粒体的观察
1.21现象:在显微镜下,可以看到呈淡黄色,透亮的块状物质,但是不能找到被染成蓝绿色的线粒体
1.22结果分析:显微镜下看到的淡黄色物质,是细胞破碎之后剩下的细胞膜脂质成分,不能被中性红染色,故呈黄色透亮状态;由于小鼠肝脏经过长期冷冻,线粒体可以已经解体或被消化,所以在实验中很难找到线粒体的染色形态
2.实验总结
在本次实验中,我学习到了细胞器分离与观察的基本 *** 、差速离心与密度梯度离心的基本原理、甲基绿-派洛宁和中性红-詹姆斯绿的染色机理和 *** ,对于以后的学习和实验都是很有帮助的;
从实验的结果上看,没有观察到着色的线粒体,究其原因,可参考文章《冷保存鼠肝脏细胞线粒体的分离》(崔泳 王金生 张文海 周勇·2000年)中得到的实验结果:4℃下保存1 h 见线粒体肿胀, 但大部分结构基本完整,轮廓和内膜嵴尚清楚。2 h 时见线粒体肿胀部分结构完整, 轮廓尚清晰, 内膜嵴不清晰, 可见空泡形成。3 h 时见线粒体肿胀结构不完整, 轮廓大清晰, 内膜嵴断裂甚至消失, 可见大量空泡形成。4 h 时见线粒体结构基本消失, 仅见线粒体轮廓…… 鼠肝冷保存超过4 h, 由于肝细胞线粒体破坏重, 仅见轮廓, 尤其在需要测定生化指标时本法不适用。为提高分离线粒体获取率。如果冷保存液改用UW 液则可获得保存时间更长的肝细胞线粒体。我们认为: 在0~4℃生理盐水保存下, 本法可以有效地分离保存3 h 以内的大鼠肝细胞线粒体。
怎样测定植物电解质渗透的测定
(一)实验材料
植物叶片。
(二)试剂
NaCl 溶液。
(三)仪器设备
电导仪,天平,温箱,真空干燥器,抽气机,恒温水浴锅,注射器。
三、实验步骤
1. *** 标准曲线 如需定量测定透性变化,可用纯 NaCl 配成 0 、 10 、 20 、 40 、 60 、 80 、 100 μg/mL 的标准液,在 20 ~ 25 ℃恒温下用电导仪测定,可读出电导率。以电导率为纵坐标, NaCl 量为横坐标做标准曲线。
2. 选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子若干,剪下后,先用纱布拭净,称取两份,各重 2 g 。
3. 一份插入小杯中放在 40 ℃恒温箱内萎蔫 0.5 ~ 1 h ,另一份插入水杯中放在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗两次,并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约 1 cm 小段放入小烧杯中(大小以能够容纳电极为度),并用玻棒或干净尼龙网压住,在杯中准确加入蒸馏水 20 mL ,浸没叶片。
4. 放入真空干燥器,用抽气机抽气 7 ~ 8 min 以抽出细胞间隙中的空气。重新缓缓放入空气,水即被压入组织中而使叶下沉。
5. 将抽过气的小烧杯取出,放在实验桌上静置 20 min ,然后用玻棒轻轻搅动叶片,在 20 ~ 25 ℃恒温下,用电导仪测定溶液电导率。
6. 测过电导率之后,再放入 100 ℃沸水浴中 15 min ,以杀死植物组织,取出放入自来水冷却 10 min ,在 20 ~ 25 ℃恒温下测其煮沸电导率。
四、结果计算
比较不同处理(萎蔫处理与对照)的叶片细胞透性的变化情况,记录结果,并加解释。
[ 注意事项 ]
1. 整个过程中,叶片接触的用具必须绝对洁净(全部器皿要洗净),也不要用手直接接触叶片,以免污染。
2. 各处理和对照的待测液的体积要一样。
3. 测定后电极要清洗干净。
[ 思考题 ]
植物抗逆性与细胞膜透性有何关系 ? 用电导仪法定量测定细胞膜透性变化为什么要用纯 NaCl 做标准曲线 ?
【附注】 DDS-11A 型电导率仪的使用 ***
1 .未打开电源开关之前,电表指针应指零;否则,应调整表头螺丝使指针指零。
2 .打开电源开关,指示灯即亮,预热至指针稳定为止。
3 .把开关拨至“校正”挡,调节“调正”旋钮使指针停在更大刻度。
4 .当被测物的电导率低于 300 μS/cm 时,将开关拨向“低周”;当被测物的电导率为 300 ~ 10 3 μS / cm 时,将开关拨向“高周”。
5 .将量程开关打到所需范围。若初测不知测量范围大小,应先将量程开关打到更大位置,然后逐格下降,以防过载,否则指针迅速摆动时易被打弯。
6 .将电极插入电极插口内,旋紧插口上的紧固螺丝,同时把电极常数调节器调节在与之配用的电极常数相应的位置上。(测量范围在 10 ~ 10 4 μS/cm 时,使用 D *** -I 型铂黑电极;当被测物的电导率大于 10 4 μS / cm 时,则应选用 D *** -10 型铂黑电极,这时应调节在与之所配用电极常数 1/10 的位置上,例如:电极常数为 9.8 ,则应调节在 0.98 位置上,但要将测得的读数乘以 10 ,即为被测液的电导率)。
7 .将电极完全浸入待测液中,把开关打到“测量”挡,从电表读数乘以量程开关所指的倍数(量程开关指红色时,读表中的红色数字;指黑色时则读黑色数字),即为被测溶液的电导率。
8 .每测完一个样品,必须用蒸馏水冲洗电极,然后用滤纸吸干水珠,再测另一个样品。
真空环境可以加速渗透吗
可以。真空渗水法的原理是将叶片打碎,利用真空抽出叶片内的空气,再使水渗透进叶片充满,然后在仪器中测定单位时间,一定光强下叶片光合作用产生并释放到水中的氧气(测氧分压得改变)。
小液流法测水势中,增加或减少蔗糖溶液中叶圆片数目是否会影响水势测定结果
增加或减少蔗糖溶液中叶圆片数目不会影响水势测定结果,因为只有水势相等时,叶片才不会上浮或是下沉,水势测定结果与叶圆片数目无关。
如果小液流停止不动,则说明溶液的浓度未有发生改变。此溶液的渗透势(水势)即等于所测组织(或细胞)的水势。根据溶液的浓度,可以用公式(ψs=-CiRT),计算出溶液的渗透势。
扩展资料
当把植物组织或细胞放在溶液中时,两者便会发生水分交换。如果植物组织(或细胞)的水势低于溶液的水势,组织(或细胞)则吸水,使外溶液浓度增大,比重也增大;若植物组织(或细胞)的水势高于溶液的水势时,组织(或细胞)则失水,使溶液的浓度变小,比重也变小。
如果植物组织(或细胞)的水势与溶液的水势相等时,外溶液的浓度不变,其比重也不变,若把浸过组织的溶液慢慢滴回同一浓度而未浸过组织或细胞的溶液中。比重小的液流便往上浮,比重大的则往下沉。
参考资料百度百科-小液流法
哪些检测属于无损检测 他们分别应用在哪些方面
实际应用中比较常见的有以下五种,也就是我们所说的常规的无损检测 *** :
一、常规无损检测 ***
目视检测 Visual Testing (缩写 VT);
超声检测 Ultrasonic Testing(缩写 UT);
射线检测 Radiographic Testing(缩写 RT);
磁粉检测 Magnetic particle Testing(缩写 MT);
渗透检测 Penetrant Testing (缩写 PT);
涡流检测 Eddy Current Testing (缩写 ET);
声发射 Acoustic emission (缩写 AE) 。
1、目视检测(VT)
目视检测,是国内实施的比较少,但在国际上非常重视的无损检测之一阶段首要 *** 。按照国际惯例,目视检测要先做,以确认不会影响后面的检验,再接着做四大常规检验。例如BINDT的PCN认证,就有专门的VT1、2、3级考核,更有专门的持证要求。经过国际级的培训,其VT检测技术会比较专业,而且很受国际机构的重视。
VT常常用于目视检查焊缝,焊缝本身有工艺评定标准,都是可以通过目测和直接测量尺寸来做初步检验,发现咬边等不合格的外观缺陷,就要先打磨或者修整,之后才做其他深入的仪器检测。例如焊接件表面和铸件表面较多VT做的比较多,而锻件就很少,并且其检查标准是基本相符的。
2、射线照相法(RT)
是指用X射线或g射线穿透试件,以胶片作为记录信息的器材的无损检测 *** ,该 *** 是最基本的,应用最广泛的一种非破坏性检验 *** 。
1、射线照相检验法的原理:射线能穿透肉眼无法穿透的物质使胶片感光,当X射线或r射线照射胶片时,与普通光线一样,能使胶片乳剂层中的卤化银产生潜影,由于不同密度的物质对射线的吸收系数不同,照射到胶片各处的射线能量也就会产生差异,便可根据暗室处理后的底片各处黑度差来判别缺陷。
2、射线照相法的特点:射线照相法的优点和局限性总结如下:
a.可以获得缺陷的直观图像,定性准确,对长度、宽度尺寸的定量也比较准确;
b.检测结果有直接记录,可长期保存;
c. 对体积型缺陷(气孔、夹渣、夹钨、烧穿、咬边、焊瘤、凹坑等)检出率很高,对面积型缺陷(未焊透、未熔合、裂纹等),如果照相角度不适当,容易漏检;
d.适宜检验厚度较薄的工件而不宜较厚的工件,因为检验厚工件需要高能量的射线设备,而且随着厚度的增加,其检验灵敏度也会下降;
e.适宜检验对接焊缝,不适宜检验角焊缝以及板材、棒材、锻件等;
f.对缺陷在工件中厚度方向的位置、尺寸(高度)的确定比较困难;
g.检测成本高、速度慢;
h.具有辐射生物效应, 无损检测超声波探伤仪能够杀伤生物细胞,损害生物组织,危及生物器官的正常功能。
总的来说,RT的特性是——定性更准确,有可供长期保存的直观图像,总体成本相对较高,而且射线对人体有害,检验速度会较慢。
无损检测X光机
用于工业部门的工业检测X光机通常为工业无损检测X光机(无损耗检测),此类便携式X光机可 以检测各类工业元器件、电子元件、电路内部。例如插座插头橡胶内部线路连接,二极管内部焊接等的检测。BJI-XZ、BJI-UC等工业检测X光机是可连接电脑进行图像处理的X光机,此类工业检测便携式X光机为工厂家电维修领域提供了出色的解决方案。
3、超声波检测(UT)
1、超声波检测的定义:通过超声波与试件相互作用,就反射、透
无损检测设备射和散射的波进行研究,对试件进行宏观缺陷检测、几何特性测量、组织结构和力学性能变化的检测和表征,并进而对其特定应用性进行评价的技术。
2、超声波工作的原理:主要是基于超声波在试件中的传播特性。
a.声源产生超声波,采用一定的方式使超声波进入试件;
b.超声波在试件中传播并与试件材料以及其中的缺陷相互作用,使其传播方向或特征被改变;
c.改变后的超声波通过检测设备被接收,并可对其进行处理和分析;
d.根据接收的超声波的特征,评估试件本身及其内部是否存在缺陷及缺陷的特性。
3、超声波检测的优点:
a.适用于金属、非金属和复合材料等多种制件的无损检测;
b.穿透能力强,可对较大厚度范围内的试件内部缺陷进行检测。如对金属材料,可检测厚度为1~2mm的薄壁管材和板材,也可检测几米长的钢锻件;
c.缺陷定位较准确;
d.对面积型缺陷的检出率较高;
e.灵敏度高,可检测试件内部尺寸很小的缺陷;
f.检测成本低、速度快,设备轻便,对人体及环境无害,现场使用较方便。
4、超声波检测的局限性:
a.对试件中的缺陷进行精确的定性、定量仍须作深入研究;
b.对具有复杂形状或不规则外形的试件进行超声检测有困难;
c.缺陷的位置、取向和形状对检测结果有一定影响;
d.材质、晶粒度等对检测有较大影响;
e.以常用的手工A型脉冲反射法检测时结果显示不直观,且检测结果无直接见证记录。
5、超声检测的适用范围:
a.从检测对象的材料来说,可用于金属、非金属和复合材料;
b.从检测对象的制造工艺来说,可用于锻件、铸件、焊接件、胶结件等;
c.从检测对象的形状来说,可用于板材、棒材、管材等;
d.从检测对象的尺寸来说,厚度可小至1mm,也可大至几米;
e.从缺陷部位来说,既可以是表面缺陷,也可以是内部缺陷。
4、磁粉检测(MT)
1. 磁粉检测的原理:铁磁性材料和工件被磁化后,由于不连续性的存在,使工件表面和近表面的磁力线发生局部畸变而产生漏磁场,吸附施加在工件表面的磁粉,形成在合适光照下目视可见的磁痕,从而显示出 磁粉检测不连续性的位置、形状和大小。
2. 磁粉检测的适用性和局限性:
a.磁粉探伤适用于检测铁磁性材料表面和近表面尺寸很小、间隙极窄(如可检测出长0.1mm、宽为微米级的裂纹),目视难以看出的不连续性。
b.磁粉检测可对原材料、半成品、成品工件和在役的零部件检测,还可对板材、型材、管材、棒材、焊接件、铸钢件及锻钢件进行检测。
c.可发现裂纹、夹杂、发纹、白点、折叠、冷隔和疏松等缺陷。
d.磁粉检测不能检测奥氏体不锈钢材料和用奥氏体不锈钢焊条焊接的焊缝,也不能检测铜、铝、镁、钛等非磁性材料。对于表面浅的划伤、埋藏较深的孔洞和与工件表面夹角小于20°的分层和折叠难以发现。
5、渗透检测(PT)
1.液体渗透检测的基本原理:零件表面被施涂含有荧光染料或着色染料的渗透剂后,在毛细管作用下,经过一段时间,渗透液可以渗透进表面开口缺陷中;经去除零件表面多余的渗透液后,再在零件表面施涂显像剂,同样,在毛细管的作用下,显像剂将吸引缺陷中保留的渗透液,渗透液回渗到显像剂中,在一定的光源下(紫外线光或白光),缺陷处的渗透液痕迹被现实,(黄绿色荧光或鲜艳红色),从而探测出缺陷的形貌及分布状态。
2.渗透检测的优点:
a.可检测各种材料,金属、非金属材料;磁性、非磁性材料;焊接、锻造、轧制等加工方式;
b.具有较高的灵敏度(可发现0.1μm宽缺陷)
c.显示直观、操作方便、检测费用低。
3.渗透检测的缺点及局限性:
a.它只能检出表面开口的缺陷;
b.不适于检查多孔性疏松材料制成的工件和表面粗糙的工件;
c.渗透检测只能检出缺陷的表面分布,难以确定缺陷的实际深度,因而很难对缺陷做出定量评价。检出结果受操作者的影响也较大。
6、涡流检测(ET)
1.涡流检测的基本原理:将通有交流电的线圈置于待测的金属板上或套在待测的金属管外(见图)。这时线圈内及其附近将产生交变磁场,使试件中产生呈旋涡状的感应交变电流,称为涡流。涡流的分布和大小,除与线圈的形状和尺寸、交流电流的大小和频率等有关外,还取决于试件的电导率、磁导率、形状和尺寸、与线圈的距离以及表面有无裂纹缺陷等。因而,在保持其他因素相对不变的条件下,用一探测线圈测量涡流所引起的磁场变化,可推知试件中涡流的大小和相位变化,进而获得有关电导率、缺陷、材质状况和其他物理量(如形状、尺寸等)的变化或缺陷存在等信息。但由于涡流是交变电流,具有集肤效应,所检测到的信息仅能反映试件表面或近表面处的情况。
2.应用:按试件的形状和检测目的的不同,可采用不同形式的线圈,通常有穿过式、探头式和插入式线圈3种。穿过式线圈用来检测管材、棒材和线材,它的内径略大于被检物件,使用时使被检物体以一定的速度在线圈内通过,可发现裂纹、夹杂、凹坑等缺陷。探头式线圈适用于对试件进行局部探测。应用时线圈置于金属板、管或其他零件上,可检查飞机起落撑杆内筒上和涡轮发动机叶片上的疲劳裂纹等。插入式线圈也称内部探头,放在管子或零件的孔内用来作内壁检测,可用于检查各种管道内壁的腐蚀程度等。为了提高检测灵敏度,探头式和插入式线圈大多装有磁芯。涡流法主要用于生产线上的金属管、棒、线的快速检测以及大批量零件如轴承钢球、汽门等的探伤(这时除涡流仪器外尚须配备自动装卸和传送的机械装置)、材质分选和硬度测量,也可用来测量镀层和涂膜的厚度。
3.优缺点:涡流检测时线圈不需与被测物直接接触,可进行高速检测,易于实现自动化,但不适用于形状复杂的零件,而且只能检测导电材料的表面和近表面缺陷,检测结果也易于受到材料本身及其他因素的干扰。
7、声发射 AE
是一种新增的无损检测 *** ,通过材料内部的裂纹扩张等发出的声音进行检测。主要用于检测在用设备、器件的缺陷即缺陷发展情况,以判断其良好性。
二、非常规无损检测 ***
声发射 Acoustic Emission(缩写 AE);
涡流检测Eddy current Testing (缩写 ET)
泄漏检测 Leak Testing(缩写 LT);
衍射波时差法超声检测技术Time of Flight Diffraction (缩写 ToFD);
导波检测Guided Wave Testing;
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